Extratos enriquecidos em uma classe particular de substâncias podem ser obtidos de duas maneiras:
A – extraíndo-se o material biológico sequencialmente, com solventes de polaridades crescentes: hexano -> éter etílico -> diclorometano -> AcOEt -> álcool (MeOH ou EtOH) -> H2O.
B – preparando-se um extrato “total”, contendo tanto substâncias polares quanto apolares, o qual é posteriormente submetido a uma série de partições, análogas ao método de Kupchan (ver a seguir), ou uma seqüência de partições ácido-base.
No primeiro método, é importante garantir que o material biológico (que deve estar triturado ou com as células lisadas) entre em contato com o solvente de extração. Normalmente, se o material biológico não apresenta uma grande superfície de contato, solventes apolares irão apenas “lavar” a superfície mais exposta.
No segundo método, prepara-se um extrato em MeOH ou EtOH, ou ainda com uma mistura de solventes (em geral CH2Cl2-MeOH 1:1), o qual é evaporado, suspendido em MeOH 90% e submetido à partição com hexano. O álcool é então evaporado antes do extrato remanescente ser submetido a partições subsequentes (ver esquema).
Solventes imiscíveis com água, apropriados para serem utilizados em um esquema de partições:
1. Álcoois: isobutanol e n-butanol (n-BuOH).
2. Cetonas: metilisobutilcetona e metiletilcetona.
3. Éteres: éter etílico e metiltert-butiléter.
4. Ésteres: acetatos de etila, butila e isopropila.
5. Hidrocarbonetos: éter de petróleo (fração leve, mistura de hidrocarbonetos C5, C6 e C7), hexano, heptano, tolueno.
6.Solventes clorados (tóxicos): diclorometano (melhor), clorofórmio (pior), CCl4 (não se deve utilizar).
Caso a extração deva ser otimizada para ser utilizada em escala semi-industrial, deve se levar em conta fatores de risco (toxicológicos) quando da manipulação de grandes volumes de solventes na extração.
“Clarificação” de extratos
Uma vez obtido o extrato desejado, este pode ser “clarificado” (ou limpo) de materiais indesejáveis, na sua maioria pigmentos.
Extratos apolares contendo clorofila podem ser clarificados dissolvendo-se o extrato em MeOH gelado (manter o frasco em banho de gelo) e adicionando-se água gelada gota a gota sob agitação magnética. Nestas condições, boa parte das clorofilas precipita, e o extrato pode ser filtrado através de celite para sua completa eliminação.
Extratos polares podem ser filtrados em Celite (terra de diatomáceas) para a remoção de pelo menos parte dos pigmentos. A lavagem da Celite deve ser cuidadosa de maneira a não deixar retido material de interesse.
Extratos medianamente polares ou polares também podem ser clarificados por extração em fase sólida, em colunas de fase reversa.
Extratos apenas solúveis em água são normalmente livres de pigmentos. Caso estes apresentem pigmentos, o extrato pode ser clarificado por adsorção reversível em resinas de poliestireno-divinilbenzeno (XAD-2) ou de outros materiais poliméricos (XAD-4, XAD-7, XAD-16), ou ainda por cromatografia de troca iônica se as substâncias a serem separadas apresentarem grupos ionizáveis.
Quanto mais limpo for o extrato a ser estudado, melhor para a avaliação da eficácia dos métodos de separação a serem empregados no isolamento de seus constituíntes.
Dicas importantes
1. Assegure-se da solubilidade do extrato ou extrato clarificado antes de proceder à sua secagem para pesagem. Às vezes depois de sêco o material pode ser difícil de ser re-dissolvido para a sua posterior manipulação. Vale a pena tomar uma alíquota do extrato, testar sua solubilidade em vários solventes, secá-la e testar a solubilidade de novo antes de proceder à secagem do extrato total.
2. Evite em princípio manipular extratos com material plástico (ponteira de pipetadoras automáticas, tubos de ensaio, etc.). Pode ocorrer adsorção irrversível de material no plástico. Use material plástico somente quando já conhecer a natureza do material que está manipulando e que este seja solúvel apenas em água.
3. Antes de descartar a fração aquosa remanescente de um procedimento de partições sucessivas, assegure-se que esta fração não contém material de interesse.
4. Apesar de ser ideal testar um esquema de extração-partição-enriquecimento de extratos com uma pequena parte do material disponível (prudência nunca é demais, principalmente se a amostra biológica obtida é de difícil obtenção!!), nem sempre isso é possível. Ainda, tais manipulações podem fornecer indicações errôneas, pois aplicar tais procedimentos a quantidades muito pequenas de material pode ser problemático. De qualquer maneira, nunca inicie a manipulação com a totalidade de material (biológico ou extratos) disponível.
5. Se durante uma partição for observada a formação de grandes quantidades de emulsão na linha de separação das fases, algumas técnicas podem minimizar o problema:
A – Não agite excessivamente o funil de separação.
B – Caso esteja realizando uma partição entre um solvente clorado (CH2Cl2, CHCl3 ou CCl4) e água, adicione pouco a pouco uma pequena (o mínimo possível) quantidade de álcool (MeOH ou EtOH).
C – Agite a emulsão levemente com um bastão de vidro.
D – Caso a emulsão seja persistente, centrifugue todo o volume caso disponha de uma centrífuga adequada.
E – Tenha paciência. A partição será tão mais eficiente quanto melhor for a separação entre as fases. Deixe a partição atingir completamente o equilíbrio (no mínimo 30 minutos).
F – Alguns sistemas de solventes que NÃO formam emulsão:
Hexano – MeOH 90%
AcOEt – H2O
CH2Cl2/MeOH (3:2) – H2O
n-BuOH – H2O
6. Procure sempre assegurar a eficácia do esquema de extração e partição e clareamento de extratos, monitorando-se por CCD ou por bioensaios (muito melhor!!).
Seja criativo, com base científica!!
Alguns extratos apresentam potente atividade biológica. Saiba aproveitá-los!
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