Químicos de produtos naturais devem, necessariamente, gostar de realizar separações cromatográficas. Isso porque o isolamento de uma substância na sua forma pura, ou quase pura, passa necessariamente por várias etapas de separação por cromatografia. Estas se dividem basicamente em 3: a) fracionamento inicial do extrato bruto; b) obtenção de frações enriquecidas em determinada(s) classe(s) de substância(s); c) purificação final.
Até cerca de 20 ou 25 anos atrás a etapa de purificação final de substâncias era feita “na unha”, ou seja, por cromatografia em coluna ou por cromatografia de camada delgada preparativa. Era necessário “ter uma boa mão” para realizar estas separações, consideradas verdadeiras artes experimentais. Com o advento e a popularização dos equipamentos de cromatografia líquida de alto desempenho, este conhecimento foi praticamente perdido.
Abre parênteses: o têrmo CLAE foi cunhado em português para a expressão “cromatografia líquida de alta eficiência”, em vez de “cromatografia líquida de alto desempenho” (CLAD), como tradução para a expressão “high performance liquid chromatography” (HPLC). Veja por quê. Fecha parênteses.
Não abordaremos nesta postagem os aspectos teóricos da cromatografia líquida de alto desempenho (doravante, HPLC), mas aspectos práticos.
Para se realizar separações por HPLC, são necessários dois ítens fundamentais: um aparelho de HPLC e uma coluna de HPLC.
Aparelhos de HPLC podem apresentar as mais diversas configurações, como: sistemas de bombeamento de um, de dois ou de quatro reservatórios. Além disso, podem apresentar detectores de índice de refração, detectores com lâmpadas de UV e monitoramento em um ou mais comprimentos de onda (λmax) fixos, detectores com arranjo de diodos, detectores eletroquímicos, de fluorescência, de dicroísmo circular, de massas, e outros. Algumas dicas interessantes para se trabalhar com sucesso com HPLC podem ser úteis para se evitar muitos problemas. Por exemplo, a seleção da coluna mais apropriada para separações cromatográficas passa pelos seguintes critérios: a) natureza da amostra que se deseja separar; b) solubilidade da amostra; c) quantidade da amostra, e; d) complexidade da amostra. Outro fator importante é a boa utilização de colunas de HPLC.
Colunas de HPLC são as melhores amigas dos químicos de produtos naturais. Por isso, devem ser muito bem tratadas, com carinho, respeito e atenção. Primeiramente: LER O FOLHETO que acompanha a coluna em sua embalagem É EXTREMAMENTE IMPORTANTE, pois este fornece informações de como guardar a coluna depois de utilizá-la e de como verificar a eficiência da coluna. É necessário sempre utilizar a coluna com solventes grau HPLC filtrados através de membranas apropriadas para eliminar eventuais partículas. Filtrar somente a quantidade de solvente a ser utilizada ao longo de um único dia, PRINCIPALMENTE ÁGUA. Utilizar somente água grau MilliQ ou similar, e NUNCA utilizar água velha (guardada). Caso sobre água MilliQ filtrada, guardar em reservatório para ser utilizada em banhos de rotaevaporadores ou banhos de ultrassom. Bons solventes garantem a extensão da vida útil das colunas de HPLC, que SÃO CARAS.
Outro fator importante é o preparo adequado da amostra a ser separada. Esta amostra DEVE ter sofrido uma, duas ou mais etapas de separação preliminares antes de ser separada por HPLC. NUNCA deve se separar um extrato bruto diretamente por HPLC sem ao menos realizar um clean-up da amostra antes. O clean-up deve ser feito com colunas pré-empacotadas (cartridges) adequadas para a posterior separação por HPLC: em fase normal ou em fase reversa. Caso a amostra seja de origem vegetal, existem também colunas pré-empacotadas com polivinilpirrolidona intercruzada, uma fase estacionária muito boa para se eliminar taninos e polifenóis (com cuidado para que compostos correlatos não fiquem retidos). Um clean-up adequado da amostra melhora consideravelmente a qualidade da separação cromatográfica que se deseja realizar.
Após a etapa de clean-up a amostra deve ser filtrada. Uma técnica adequada é através de um pequeno chumaço de algodão bem prensado em uma pipeta Pasteur. Pode-se fazer a filtração sob pressão de ar comprimido ou N2 (melhor), caso a amostra apresente muitas partículas. Finalmente, a amostra deve ser completamente solúvel na mistura solvente que se deseja utilizar. Se não for, é necessário filtrar novamente antes de se iniciar as separações. Caso existam partículas na amostra, estas poderão entupir a pré-coluna, ou a coluna, caso não se utilize uma pré-coluna. Todavia, o ideal é se utilizar SEMPRE pré-coluna. A utilização de pré-colunas aumenta consideravelmente o tempo de vida útil das colunas de HPLC. Por isso é importante não se re-utilizar o “recheio” das pré-colunas. Estes devem ser descartados após 1 dia de uso, ou ao final de uma série longa de injeções da mesma amostra, principalmente se forem realizadas separações em escala preparativa ou semi-preparativa. Para isso, existem pré-colunas com “recheio” pronto (na forma de pastilhas) e também pré-colunas nas quais é possível se esvaziar o recheio utilizado e colocar outro, novo.
Deve-se verificar constantemente a pressão do sistema em operação, para se observar qualquer anomalia, como partículas que possam entupir a tubulação de aço inox, ou o sistema de injeção, além da pré-coluna ou da coluna. Para tanto, é necessário selecionar adequadamente a faixa de pressão de trabalho, de acordo com as especificações do equipamento e da coluna em utilização.
Manter o sistema de HPLC limpo é imprescindível para se evitar a presença de contaminantes no aparelho. Limpezas periódicas (a cada 6 meses) em um sistema de HPLC muito utilizado podem ser realizadas utilizando-se a seguinte sequência de solventes (fluxo: 1 mL/min, durante 30 minutos cada solvente): MeOH, H2O, HNO3 concentrado diluído a 50% (1 hora), H2O, MeOH, MeCN, i-PrOH, MeOH. Obviamente que esta limpeza deve ser realizada com a tubulação desconectada de qualquer coluna ou detector. Para se limpar um detector, pode-se utilizar a sequência MeOH, MeCN, i-PrOH, MeOH.
Quando se iniciar o condicionamento da coluna, aumentar gradativamente o fluxo de solvente, em intervalos de 0,1 mL/min, observando-se a estabilização da pressão do sistema entre dois aumentos subsequentes do fluxo. Deve-se observar se o fluxo e a pressão estão estáveis, sem variações significativas. Variações de pressão podem indicar a presença de bolhas de ar no sistema. Neste caso, deve-se retirar a coluna e purgar o sistema com MeOH antes de se re-condicionar o sistema novamente. Para se evitar a formação de bolhas de ar no interior de um sistema de HPLC é necessário se degaseificar os solventes a serem utilizados em banho de ultrassom e sob vácuo durante 10 minutos. Um fluxo anômalo também pode ser um indicativo de bolhas ou de conexões de má qualidade. O fluxo pode ser verificado cronometrando-se o tempo necessário para se atingir um volume de 10 mL em proveta (medida em triplicata). Se houver uma variação significativa entre as medidas de fluxo, bolhas ou conexões de má qualidade podem estar comprometendo o fluxo regular do sistema.
A qualidade da coluna é importante e deve ser periodicamente verificada se houver variações de reprodutibilidade. Para tanto, deve-se utilizar a mistura de padrões indicada pelo fabricante no relatório de controle de qualidade que acompanha a coluna, dependendo do tipo de coluna utilizada. É útil se observar a reprodutibilidade caso ocorra variações significativas no padrão de separação de uma mesma amostra utilizando-se as mesmas condições de separação.
Por fim, deve-se sempre lavar a coluna ao final de um dia, ou de uma série contínua de separações de uma mesma amostra. Para tanto, utilizar 100% do solvente orgânico utilizado como eluente. Isso somente depois de se remover quaisquer traços de ácidos (TFA, HCO2H), bases ou sais que possam ter sidos utilizados na mistura eluente. Para isso, deve-se primeiro lavar a coluna com 100% H2O, depois H2O/solvente orgânico, depois 100% solvente orgânico, guardando-se a coluna em 60% solvente orgânico/40% H2O (usualmente recomendado). Indicar com uma etiqueta a composição da mistura em que a coluna foi guardada é sinal de bom profissionalismo, e os colegas que forem utilizar a mesma coluna posteriormente agradecerão.
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