Artigo recentemente publicado na revista PLoS ONE relata a importância em se identificar padrões a serem utilizados em, por exemplo, comparações de ocorrência de substâncias naturais em extratos vegetais. O estudo relata a necessidade da identidade do padrão “galato da epicatequina” (1) na avaliação de polifenóis presentes em extratos de chá verde, pelo fato de, apesar de ter apresentado características físicas e comportamento cromatográfico condizente com o esperado, ser outra substância, completamente diferente (2).

Por isso os autores questionaram a validade de vários trabalhos já publicados, que não relataram a análise dos padrões utilizados.

Os autores observaram que, nas condições de análise por HPLC utilizadas, o composto 2 apresenta o mesmo tempo de retenção relatado para o composto 1 na literatura. Todavia, e naturalmente, o composto 2 não apresentou a atividade antioxidante esperada para o composto 1. E decidiram obter o espectro de RMN-¹H do padrão. Para confirmar a identificação, os autores também obtiveram os espectros no IV, no UV-Vis e de massas para o padrão. Todas as análises confirmaram a estrutura 2. O padrão, que deveria ser a substância 1, foi comprado da empresa Sigma-Aldrich.

Os autores questionaram, assim, os próprios resultados obtidos durante anos para análises de folhas de chá verde. E recomendam que pesquisadores ou analistas que realizam análises por HPLC similares validem a identificação dos padrões antes de assumir que o padrão que estão utilizando seja realmente a substância que se espera.

Será que os exemplos utilizados no artigo são os melhores? Afinal, a substância 2 não apresenta absorção no UV acima de λ_max 220 nm, enquanto que a substância 1 apresenta absorção no UV acima de _λmax 280 nm. Qualquer analista que utilizar HPLC com detecção no UV perceberá que, neste caso, existe um problema com seu padrão. Isso é válido tanto para detecção no UV em comprimento de onda fixo ou variável (arranjo de diodos). Vamos supor que tenhamos que utilizar detecção por índice de refração. Neste caso, o índice de refração dos dois compostos, 1 e 2, também será completamente diferente. Bem como seus espectros de massas. Bem como a volatilização para detecção por espalhamento de luz evaporativo. Ou seja, qualquer que seja o método de detecção utilizado nesta análise mostrará que existe um problema com o padrão. Se o analista que realiza as análises não perceber isso, existe um problema com o analista (além do problema com a análise).

OK…

Referência

Dovi Kelman, Anthony D. Wright, The Importance of ¹H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for Reference Standard Validation in Analytical Sciences, PLoS ONE 7(7): e42061. doi:10.1371/journal.pone.0042061

Categorias:química de produtos naturais

Tags:chá verde, HPLC, padrão, polifenóis