As reações de cicloadição pertencem a uma classe de reações “especiais” por seguirem regras muito particulares – as chamadas regras de Woodward-Hoffmann. Estas regras se fundamentam na teoria dos orbitais de fronteira, uma teoria extremamente elegante, proposta ao mesmo tempo por Hoffmann e Fukui. Embora pareçam difíceis de serem compreendidas, as regras de Woodward-Hoffmann são relativamente simples, e explicam a formação de ligações químicas através da interação de orbitais moleculares maior energia ocupados por elétrons – os orbitais chamados de HOMO, highest occupied molecular orbitals – com orbitais moleculares de menor energia que não estão ocupados por elétrons – orbitais chamados de LUMO, lowest unnoccupied molecular orbitals¹.

Dentre as reações de cicloadição, a reação do tipo [4+2] é considerada a mais comum. Porque se chama “do tipo [4+2]”? Porque resulta da interação de um reagente com 4 elétrons em ligações π com outro reagente que possui 2 elétrons em uma ligação π. Daí o nome [4+2]. Também é conhecida como sendo reação de Diels-Alder, em homenagem a seus dois descobridores (que ganharam, por isso, o prêmio Nobel de química em 1950).

A reação de cicloadição do tipo [4+2] é extremamente versátil, e muito utilizada em síntese de moléculas orgânicas. Porém, o mais interessante é que se suspeita que muitos produtos naturais originários de organismos vivos sejam formados bioquimicamente por uma etapa envolvendo uma reação deste tipo². Porém, até uma semana atrás não se conhecia um processo enzimático específico que fosse responsável por promover uma reação de cicloadição [4+2].

No primeiro artigo do número da revista Nature da semana passada os autores apresentam evidências de que um produto natural isolado de uma bactéria, Saccharopolyspora spinosa, é formado por um processo catalizado por uma enzima que promove uma reação de cicloadição [4+2]. Uma descoberta e tanto. A enzima responsável pela reação do tipo [4+2] atua no processo de biossíntese da spinosina A.

A siposina A (estrutura 1 no esquema a seguir; clique na figura para ampliar) é um componente ativo de vários inseticidas utilizados comercialmente. Muito já se especulou como sua estrutura complexa seria formada. Principalmente o anel do tipo ciclohexeno presente na estrutura 1 (destacado em vermelho). Diferentes autores já propuseram que este ciclo seria formado por uma reação do tipo cicloadição [4+2], catalizada por uma enzima do tipo “Diels-Alderase”.

De maneira a investigar a rota biossintética da formação da spinosina A, os autores do trabalho da Nature tentaram descobrir a função dos produtos de quatro genes de S. spinosa, denominados spnF, spnJ, spnL e spnM³. No seu conjunto, tais genes são responsáveis pela transformação do macrociclo 2 no composto tetracíclico 4. O gene spnJ já havia sido previamente estudado, e observou-se que codifica a formação de uma enzima do tipo desidrogenase dependente de flavina, responsável pela oxidação do grupo H-C-OH da posição 15 da substância 2 dando origem ao grupo C=O do mesmo carbono na substância 3.

Os genes spnF, spnL e spnM foram heterologamente super-expressos pela bactéria Escherichia coli⁴, e seus produtos foram purificados. Cada uma das proteínas biossintetizadas foram testadas sobre o substrato 3. A transformação da substância 3 foi observada após 2 h de incubação com a proteína SpnM, dando origem à substância 8, passando pela formação da substância 5. Ou seja, o processo catalizado por SpnM compreenderia duas etapas: a desidratação-1,4 da substância 3 seguida da cicloadição transanular do tipo [4+2] entre os carbonos da substância 5 situados nas posições 4 e 7 por um lado e 11 e 12 por outro lado. Porém, verificou-se que a enzima SpnM é responsável somente pela etapa de desidratação. Por isso, os autores pensaram que a reação de cicloadição ocorreria espontaneamente, sem a necessidade de uma enzima catalizadora. Todavia, quando a substância 5 foi incubada na presença de SpnF observou-se a formação do produto 8. E a formação de 8 mostrou ser dependente da concentração de SpnF, que apresenta um atividade enzimática de k_cat 14 +/- 1,6 min^-1, correspondendo a um aumento estimado de taxa  de conversão de 5 para 8 de 500 vezes (ou seja, a conversão de 5 em 8 é cerca de 500 vezes mais rápida na presença de SpnF).

A função de SpnG mostrou estar associada à transformação da substância 8 para formar a substância 10. Esta última substância é, por sua vez, o substrato da enzima SpnL que dá origem ao composto 13, o precursor imediato da spinosina A.

A maneira como a enzima SpnF realiza a conversão de 5 em 8 parece indicar que atua favorecendo uma reação do tipo Diels-Alder. Porém, o mecanismo de formação de 8 não pôde ser totalmente confirmado. É necessário que se confirme que a reação ocorre em uma só etapa, com um estado de transição ilustrado pelo composto 6. Os autores argumentam que no estágio atual da investigação do mecanismo da formação de 8 não se pode descartar uma outra possibilidade: que a reação ocorra através da formação de um intermediário dipolar do tipo 7. Fato interessante, outros pesquisadores que realizaram a síntese química da spinosina A utilizaram reações análogas àquelas atribuídas às enzimas SpnF (cicloadição [4+2], tipo Diels-Alder) e SpnL (reação de Rauhut-Currier).

A enzima SpnF é a primeira que cataliza especificamente uma reação de cicloadição do tipo [4+2]. Outras enzimas já foram obtidas de outros microrganismos que catalizam reações do tipo cicloadição [4+2] e outras reações, não sendo, assim, específicas. Caso se verifique que a reação de conversão de 5 em 8 seja realmente uma reação de Diels-Alder, a enzima SpnF deverá ser o primeiro exemplo de uma Diels-Alderase.

Notas e referências

1. Para uma explicação sobre as regras de Woodward-Hoffmann e sobre a teoria dos orbitais de fronteira, veja aqui.

2. Uma excelente revisão bibliográfica sobre este tópico: Oikawa, H. and Tokiwano, T. Enzymatic catalysis of the Diels–Alder reaction in the biosynthesis of natural products. Nat. Prod. Rep., 2004, 21, 321-352.

3. Na notação atual, spnF, spnJ, spnL e spnM são genes que codificam a formação de proteínas SpnF, SpnJ, SpnL e SpnM.

4. A expressão heteróloga de um gene consiste em transferi-lo do organismo do qual toma parte no genoma para outro organismo, em geral uma bactéria. Uma vez transferido, deverão ser encontradas condições necessárias para a expressão do gene pelo organismo que o recebeu. A vantagem da expressão heteróloga de genes por Escherichia coli é que esta bactéria é muito bem conhecida, podendo ser facilmente manipulada e crescida em meio de cultura.

Kim, H., Ruszczycky, M., Choi, S., Liu, Y., & Liu, H. (2011). Enzyme-catalysed [4+2] cycloaddition is a key step in the biosynthesis of spinosyn A Nature, 473 (7345), 109-112 DOI: 10.1038/nature09981

Categorias:biossíntese, química de produtos naturais

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